（报告出品方/作者：兴业证券，孙媛媛、李博康）
1.病*载体：最常用的基因递送载体之一
1.1病*载体是通过改造病*来递送基因的常用工具
病*载体是一种常用的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病*具有传送其基因组进入其他细胞进行感染的分子机制。病*是一种由核酸分子和蛋白质构成的非细胞形态生物，能够携带基因进入受体细胞，经开发和改造后可用作CGT载体。由于病*的多样性及宿主机体的高度复杂性，目前仅腺病*、腺相关病*、慢病*、逆转录病*和溶瘤病*等少数种类可改造为CGT载体。经过改造且携带治疗性基因的病*，即重组病*载体。通过改造后的病*载体一般具有更好的安全性和更快的分子克隆速度，同时感染能力也得到了定向进化，从而具备了更快捷、更广谱的转导特性，以及更安全、更特异的感染特性。病*载体可通过受体配体识别、细胞内吞等多种途径进入细胞，并完成目的基因递送。
1.2病*载体在基因治疗和细胞治疗产业有重要的地位
在基因和细胞治疗中，使用的载体可以分为病*载体和非病*载体；迄今为止，大多数基因疗法利用病*载体来传递目标基因。据SamanthaL.Ginn综述文章的统计，在-年间基因治疗的所有临床试验中，使用病*载体的临床占总数的67.3%。根据《AnAnalysisOfTheGeneTherapyViralVectorLandscape》，目前常用的病*载体包括腺相关病*（AAV）、慢病*（LV）、仙台病*、腺病*（AdV）、逆转录病*和溶瘤病*等，相比于腺病*和逆转录病*来说，慢病*载体和AAV载体安全性较好，二者在临床试验中使用的数量也越来越多。非病*载体主要有脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒，外泌体等。该类载体具有低免疫原型、低成本、易规模化生产等优点，但转染效率、细胞*性、靶向性等问题还有待解决。
2.细胞治疗与基因治疗（CGT）高速发展，助力病*载体生产行业爆发
病*载体是细胞治疗与基因治疗的重要物料，而伴随着细胞治疗和基因治疗的高速发展，病*载体生产行业正在迎来重大利好。
2.1细胞治疗和基因治疗迎来高速发展期
CGT行业正准备进入快速发展阶段，-年临床试验数量复合年均增长率超60%。根据弗若斯特沙利文年发布的报告《中国细胞与基因治疗发展白皮书》，中国CGT临床试验数量爆发式增长，数量仅次于美国，结合国家利好*策的推动，CGT行业将进入快速发展阶段。自年开始，中国CGT疗法的临床试验数量快速增长。年至年间，中国累计开展了约项CGT临床试验，已成为数量仅次于美国的地区，复合年均增长率超过60%，位列全球第一。截至年6月，中国正在开展的CGT临床试验约项，涉及大小公司约80家。CGT药物全球商业化进程持续加快，在研CGT临床试验项目已近项。在技术、资本和*策的驱动下，全球CGT行业快速升温，大量CGT药物研发进入临床阶段，并自年起呈现爆发式增长。根据ASGCT（AmericanSocietyofGene+CellTherapy，美国权威的细胞和基因治疗协会）的数据，截至年底，全球累计在研CGT临床试验超过1,项，到年第一季度末已达到1,项。
根据弗若斯特沙利文的统计，全球CGT行业市场规模自年开始飞速增长，预计中国CGT行业市场规模在*策利好及研发投入增长的背景下也将快速扩增。年全球整体市场规模或可到亿美元（复合年均增长率71%），中国整体市场规模达29.5亿美元（复合年均增长率%）。
年至年，全球CGT市场规模从0.5亿美元增至20.8亿美元，复合年均增长率约为%。根据弗若斯特沙利文咨询预测，未来CGT市场规模仍保持快速增长趋势，预计于年全球整体市场规模为.4亿美元，年至年（估计）全球CGT市场复合年均增长率约为71%。
年至年，中国CGT市场规模从0.02亿美元增至0.03亿美元，复合年均增长率约为12%。根据弗若斯特沙利文咨询预测，预测未来中国CGT市场规模仍保持快速增长趋势，于年整体市场规模为25.9亿美元，年至年（估计）中国CGT市场复合年均增长率约为%。
2.2病*载体的生产对CDMO产业依赖度高
病*载体的生产是细胞与基因治疗CDMO市场最为关键的细分领域之一。CGT公司约八成为初创公司，与基础研究转化联系紧密，依赖CDMO提供产业化服务。根据ARM报告、弗若斯特沙利文分析，截至年12月31日，全球约家CGT公司中，79.1%为初创公司；截至年7月20日，在中国CDE有产品临床试验公示的48家CGT公司中，75.0%为初创公司。CGT初创新药企业在药物开发、临床申报至商业化生产过程中，由于受到工艺开发能力、GMP生产经验、临床申报相关法规知识的限制，更多依赖专业的CRO和CDMO。据和元生物招股书的数据，基因治疗外包渗透率超过65%，远超传统生物制剂的35%。
全球CGTCDMO行业处于快速发展阶段。根据和元生物招股书的数据，年至年，全球CGTCDMO市场规模从7.7亿美元增至17.2亿美元，复合年均增长率达22.4%；预计到年，全球CGTCDMO市场规模将达到78.6亿美元，年至年的复合年均增长率将上升至35.5%。预计到年，全球范围内，欧美发达地区的CGTCDMO行业发展相对更为成熟，市场规模更大，行业格局更为成熟稳定；目前市场参与者主要包括Lonza、Catalent、OxfordBioMedica、药明康德等巨头。国内CGTCDMO行业经过近年的稳定增长，即将迈入高速发展阶段。年至年，预计中国CDMO市场规模将从8.7亿元增长到32.6亿元，复合年均增长率达39.3%；预计到年，市场规模将增至.4亿元，年至年的预期复合年均增长率将高达43.3%。与欧美市场相比，当前国内CGTCDMO行业正处于发展初期，但近年来市场规模快速扩大，增长态势良好。国内主要从事CGTCDMO业务的公司包括药明康德子公司无锡生基医药、金斯瑞生物科技、博腾股份子公司博腾生物等。
2.3病*载体生产产能紧张，供不应求
病*载体生产产能紧张，供不应求。病*载体外包率远高于传统生物制剂，而下游产品型企业往往需要较长的等待期。与此同时，病*载体生产需要预留定金，这种在CDMO行业罕见的行为也显示了其供不应求的状态。Catalent和ThermoFisher都有在产能还没释放时收到客户提前支付的产能预留定金的情况，这在传统的CDMO行业中是从未存在过的。目前该领域存在较大未被满足的产能需求。年发表在NCBI的一篇文章估计，病*载体的生产能力需要增加1-2个数量级才能满足最终的商业需求。尽管自年以来产能明显增长，但自年以来飞快进展的临床项目也极大地增加了产能的需求。
3.当前使用最广泛的两种病*载体：腺相关病*(AAV)和慢病*(LV)
腺相关病*(AAV)和慢病*(LV)是当前使用最广泛的两种病*载体，其中AAV常用于基因治疗，LV常用于细胞治疗。LV基因组长度为9kB，有更强的嗜性，能够感染非分裂细胞，同时在安全性上较逆转录病*(RV)更安全；AAV基因组长度为4.8kB，其宿主范围极为广泛，长时程基因表达，治疗效果持久，同时其免疫原性极低，肝*性低，但包装容量小，感染到表达的时间比较长。
3.1腺相关病*载体：基因治疗的万金油，广泛用于体内或全身基因治疗
3.1.1腺病*载体年被发现，年第一次用于人类疾病治疗
腺相关病*(AAV)最早于年首次在实验室的腺病*制剂中被发现，随后科学家对其进行了多角度的研究。年成功完成了AAV2基因组的克隆以及测序工作。年，AAV载体首次用于治疗人类的囊性纤维化病。进入21世纪后，科研人员发现了更多不同的AAV血清型家族，丰富了AAV载体的选择范围。年，科研人员在治疗莱伯氏先天性黑蒙症时利用了基于AAV载体的基因疗法，获得了良好的成果。年，第一个基于AAV用于治疗脂蛋白脂酶缺乏症LPLD的基因治疗药物Glybera获得了欧洲药品管理局EMA的批准。5年后，治疗由RPE65基因突变导致的遗传性视网膜疾病的AAV基因治疗产品Luxturna获得美国食品药品管理局FDA的批准。
3.1.2腺相关病*是一种安全性较高的细小病*，通过整合到人类基因组中实现长期潜伏
AAV属于细小病*科依赖性细小病*属，它由一个直径约26nm的二十面体蛋白质衣壳和一个约4.8kb的单链DNA基因组组成，该基因组可以是正义链也可以是反义链。病*衣壳由VP1、VP2和VP3三种亚基构成，三种亚基的比例为1：1：10，共60份拷贝。目前的普遍共识是AAV病*不会引起人类疾病，安全性非常高。
在人类细胞中，AAV基因组可以整合到一个被称为AAVS1的基因组位点从而实现长期潜伏。这一现象的部分原因是AAVS1位点的序列和ITR的序列有很大的相似性，位点的插入同样需要rep基因编码蛋白的活性，缺乏rep基因的重组AAV载体的基因组整合效率会大大降低。纯化后的AAV病*载体可以用于侵染细胞，侵染细胞时，AAV与细胞表面特异性受体结合，激活胞内信号通路，进而触发AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞，在核内体、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核，随后病*裂解，其单链DNA需复制成为双链DNA后表达目的基因。
3.1.3AAV载体改造策略：分型发现、设计及修饰
为了将野生型AAV变成适合体内基因递送的重组型AAV载体，研究人员对其进行了一系列的遗传改造。重组型AAV载体的病*衣壳依然沿用野生型AAV的序列与构造，如完全剔除了rep基因和cap基因，仅仅保留有了负责引导病*载体基因组复制和包装的ITRs序列。与野生型AAV相比，这种改造在很大程度上提高了AAV载体的装载量并极大程度上降低了体内免疫原性和*性。与AAV载体复制和装配相关的rep、cap基因元件以及腺病*辅助基因元件被分别克隆到其它质粒载体上，这样的设计允许利用多质粒瞬转系统大量制备科研或者临床级别的重组AAV载体产品。
3.1.4AAV载体的优势与面临的挑战
AAV载体具有器官靶向性、安全性高以及长效性等优点，但同时存在包装容量小、感染到表达的时间比较长等缺点。重组的AAV2血清型病*载体仍然处于主流位置。从-年的项披露了AAV病*衣壳数据的临床试验中分析发现，重组的AAV2血清型仍然处于主流位置，并且具有最多的安全性和有效性证据，截至年末已经有超过40项使用AAV2病*载体的临床试验完成全部流程。利用组织特异性启动子实现组织特异性表达成为新趋势。从项披露了启动子数据的临床试验中分析发现，像CBA、CAG和CMV等泛表达类的启动子依然受到研究者的广泛青睐，而在-年间，超过25项临床试验使用了组织特异性启动子来实现特定组织的表达，例如白蛋白启动子和突触蛋白启动子等。
3.1.5基于AAV载体的基因治疗临床试验数量猛增
截至年6月，在ClinicalTrials.gov上登记了项以AAV为载体的基因治疗临床试验。年-年6月，临床以AAV为载体的基因治疗试验数量增长迅猛，从年的不足10个增至年11月的个，再到年6月进一步提升至个。尽管临床试验中所用最多的是基于AAV2血清型的载体，但是新的血清型如AAV8、AAV9也在不断被用于临床试验。大多临床试验通过进行I/II期合并临床试验以加速研发进程。以AAV为载体的基因治疗主要靶向眼、肝、肌肉和脑部，其中尤以靶向眼部疾病的临床试验数量为多，占比约21%。
3.1.6AAV载体生产方式主要有三种，基于Sf9细胞的杆状病*表达载体系统是实现大规模生产的重要方法
在AAV载体的生产中，目前主流的方法主要有三种：1、基于HEK细胞的三质粒转染系统；2、哺乳动物稳定细胞系；3、基于夜蛾昆虫细胞(Sf9)的杆状病*表达载体系统。1、HEK三质粒共转染工艺的方法是研究级与临床前使用的AAV载体的主要生产方式；HEK三质粒转染中的质粒分别有：含ITRs和目的基因的顺式质粒、含rep和cap基因的反式质粒、提供E2a/b、E4和VARNA基因的Ad辅助质粒三种质粒，共转染HEK细胞（表达E1a和E1b基因）来生产AAV载体。此方法中细胞通常以半贴壁的方式培养，在转染后2-3天达到最高生产力，随着时间的推移失去活力。2、哺乳动物稳定细胞系：上世纪90年代，Clark等人将rep/cap和AAV载体基因组克隆到表达质粒中，并使其稳定感染Hela细胞，首次建立了基于Hela的生产细胞系。近来开发的混合rAAV/rAd载体，将转基因载体和腺病*元件同时递送，从而使稳定整合的AAV基因在Hela细胞系中获得rep-cap的高表达。稳定细胞系生产可以消除常规生产中的外来辅助污染物（如外源性病*、质粒污染物等）。但是稳转株内的基因产物可能组装成杂质，造成潜在的安全隐患。3、杆状病*/Sf9系统是在锥体夜蛾昆虫细胞(Sf9)中使用杆状病*表达载体(BEV)来生产AAV病*载体。该方法是利用携带AAV载体基因组的BEV感染Sf9细胞。由于杆状病*具有辅助功能，BEV系统与Sf9细胞系结合可以稳定表达，用于高滴度的大规模载体生产。
3.2慢病*载体：体外基因修饰细胞治疗（含CAR-T疗法）最常用的载体
3.2.1慢病*载体是基因治疗和CAR-T细胞治疗的重要物料
慢病*载体（LVs）是传递遗传物质最常用的转移载体之一，也是改造造血细胞以纠正原发性免疫缺陷、血红蛋白病和白血病的首选载体。慢病*载体也被广泛用于修改T细胞以通过免疫疗法治疗癌症（如嵌合抗原受体T细胞疗法，CART）。在基因组编辑中，LV被用来传递序列特异性设计核酸酶和DNA模板。
3.2.2LVs载体的前身是HIV-1，具有免疫原性低、安全性高等多重优点
慢病*（Lentivirus）载体是一种单链RNA病*，是以人类免疫缺陷型病*（HIV）为基础发展起来的CGT载体，能够感染分裂和非分裂细胞。慢病*可以将外源片段随机插入细胞基因组，因此可以在体内长期表达目的基因，同时慢病*载体具有表达时间长、安全性高等优点，是重要的基因操作工具。
慢病*基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生小RNA。慢病*介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。
3.2.3四质粒共转染工艺是LV载体生产的最常用方式，稳定转染生产细胞系可能是未来工业大规模连续过程的理想系统
HIV维持生存的基本基因包括gag、pol和env基因；gag编码结构蛋白，pol编码逆转录酶和整合酶，env编码病*包膜糖蛋白。LV的构建基于野生型HIV-1病*。为了避免有复制能力病*（RCV）的产生，在构建HIV-1型病*载体时一般将HIV-1基因组分装于几个质粒载体中，再共转染细胞，然后获得只有一次感染能力而无复制能力的HIV-1载体颗粒。
四质粒共转染工艺（第三代系统）是目前用于研发和临床的最多的系统。该系统由1个包含目的基因的表达质粒、2个包装质粒、1个包膜蛋白质粒，共4个质粒组成。包装构建体在此系统中被进一步拆分，gag-pro-pol和rev基因被分离在两个独立的质粒中。包膜蛋白质粒使用水疱性口炎病*的糖蛋白G基因（VSVG）替代了病*原有的env基因。应用了VSV-G包膜的假构型慢病*载体，扩大了载体的靶细胞嗜性范围，同时也增加了载体的稳定性。四质粒包装系统，极大地降低了产生具有复制能力慢病*的可能性，而VSV-G蛋白的使用也降低了这种重组的可能性。更新的第四代系统通过密码子优化，对rev蛋白（促进晚期基因转录的因子）的需求也被取消。但是滴度较低，应用尚少。
稳定包装细胞系提供了可重复的和可扩展的生产过程，同时降低了成本，且由于降低了病*表达载体之间的重组概率，生产的安全性也得到了提升。其可扩展性还可以适应无血清悬浮培养体系。所以在慢病*生产中稳定包装细胞系的应用是要优于瞬时转染系统的，虽然建立慢病*生产稳定细胞系也存在诸多困难，特别是一些病*蛋白对细胞具有显著*性，但这依然是行业未来发展的一个重要方向。
4.病*载体的生产工艺复杂，扩大培养与纯化是难点
4.1病*载体生产工艺总览
病*载体生产分为上游（生产）工艺（USP）和下游（纯化）工艺（DSP）；上游生产工艺包括：细胞复苏→细胞扩增→接种、转染、诱导→收获；下游包括：纯化→浓缩→制剂→灌装、包装；
4.2上游工艺之细胞扩增培养——成熟贴壁培养与前景广阔的悬浮培养
在细胞扩增培养方面，目前广泛使用的是从实验室研究中沿袭下来的细胞贴壁培养技术，被用于生产大约70%的病*载体产品。AAV和LV载体生产最常用的是使用贴壁培养的人胚胎HEK细胞。在贴壁细胞培养中，细胞以单层形式附着在基质上生长。而在悬浮细胞培养中，细胞在培养基中自由漂浮。贴壁培养常常被用于生产小剂量的病*，操作简单，可满足部分工业需求。但是在大规模生产中也有处理复杂、容易污染、培养条件控制与检测困难等问题。微载体培养技术在一定程度上解决了贴壁细胞的部分缺点，工艺放大相对容易。而悬浮无血清细胞培养系统，使得AAV生产的工艺放大更为容易，为AAV下游纯化减少了负担。
4.3上游关键工艺之转染——高效的瞬时转染与长期性的稳定转染
转染是指是将目的基因转染至特定哺乳动物细胞内的方法。目前工业生产中的转染方式主要有瞬时转染与稳定转染两种。瞬时转染中，外源基因并没有转染到细胞的染色体上而是存在于游离的载体上，这样可以在短时间内获得基因的表达产物，但是随着细胞的不断分裂增殖外源基因最终会丢失，无法继续进行重组蛋白的生产；而利用细胞稳定转染则会将外源基因转染至细胞染色体上，目的基因不会随着细胞传代而消失，稳定转染的细胞株能够长期稳定的生产目的蛋白。
瞬时转染和稳定转染各有优缺点，需要按照实际场景而使用：瞬时转染多用于贴壁细胞系，而稳定转染多用于悬浮细胞系。大部分瞬时转染载体的生产使用贴壁性细胞系，其中所选培养容器需要有利于它们附着、生长和生产病*载体的表面。而稳定生产的细胞系通常是适应悬浮的细胞系，不需要基质附着、生长和生产病*载体。因此，需要在临床开发的早期就要确定CGT所需的目标剂量和患者群体，以指导选择最优载体生产平台，从而满足未来的商业化需求。瞬时转染工艺成熟，使用广泛；与稳定的生产细胞系相比，基于瞬时转染的病*生产相关的工艺开发时间相对较短，生物制药行业已经有多家成熟的供应商，拥有高效瞬时转染类载体生产需要的各种工具。同时可保持长期稳定生产的稳定转染工艺也逐步被产业重视。使用稳定的生产细胞系的载体生产方法虽然相对较新，不过其有很大潜力可支撑行业不断增长的产量需求。
4.4除杂提纯是下游工艺的关键
（1）下游纯化工艺的一般过程。下游纯化工艺方案通常采用相似的工作流程：①澄清步骤（由于收获时需进行细胞裂解，可能需要额外进行深层过滤）②纯化步骤（通常采用离子交换法或亲和层析法）③精纯步骤（额外的层析法步骤/尺寸排阻）。（2）控制污染物与杂质是下游工艺的核心