1、什么是VSV
2、VSV的基因组结构
3、VSV假病*包装原理
4、VSV假病*应用举例
什么是VSV
VSV是Vesicularstomatitisvirus的缩写，中文名称为“水疱性口炎病*”，属于水泡性病*属，弹状病*科（Rhabdoviridae），其外形如同其名字呈现出子弹型。
水泡性口炎病*负染照片
弹状病*的宿主范围很广，包括哺乳动物、鱼类、植物和昆虫等；很多弹状病*是动植物的病原。弹状病*属于弹状病*科，下辖多种病*属：
弹状病*举例
VSV能感染牛、马、羊和猪等多种动物并致病，表现为足部和口部病变，其症状和手足口病相似。这种疾病可能降低奶制品和肉制品产量，加上必要的检疫隔离和贸易壁垒等，导致严重的经济损失。VSV主要流行于热带和某些温带地区，英国尚未出现该病*感染的报道。
VSV的宿主范围极其广泛。除了家畜，蝙蝠、鹿和猴子等许多野生动物体内都检测到VSV中和抗体存在，表明这些动物同样会感染VSV。此外，蚊子、沙蝇和黑蝇等多种昆虫体内也分离到该病*。目前，VSV在自然条件下的传播循环机制尚不明确。有理论认为，VSV可能通过一种或多种昆虫媒介在哺乳动物间传播。
人对此病*易感，引起流感样症状，多数人一周内康复，可产生中和抗体。
实验室条件下，哺乳动物、鸟类、鱼类昆虫和线虫等来源的多种细胞都能够支持VSV的复制。相比于狂犬病*，VSV的安全等级较低，比较容易开展研究。目前关于弹状病*结构和复制机制的大多数认知都是基于VSV的研究。
VSV的基因组结构
野生型的VSV是一种由包膜病*，其病*体结构呈弹状或杆状，拥有一条单链负义RNA基因组（-ssRNA），并且其复制依赖病*的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRp）。含有5种结构蛋白：核蛋白（N），磷酸化蛋白质（P），RNA聚合酶（L），基质蛋白（M）以及糖蛋白（G）。
VSV病*颗粒中，其RNA基因组与N核蛋白组成核糖核酸蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）。其中，核苷酸与N蛋白的比例约为9:1。
P和L蛋白则组成RdRp，并结合于RNP。L蛋白因为其分子量巨大而得名，几乎一半的病*基因组用于编码该蛋白。L蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，能够催化病*基因组的转录过程。但是只有当P蛋白以3:1的比例与L蛋白结合的时候，L蛋白才具有聚合酶活性。L蛋白还能催化mRNA的加帽和多聚腺苷酸化。
VSV感染靶细胞时，其G糖蛋白诱导细胞发生内吞作用，帮助病*侵入细胞。G糖蛋白可以介导病*包膜与细胞膜融合，促使RNP和RdRp一起释放到细胞质中。病*组分进入细胞后，RdRp以RNP中的负义RNA基因组为模板立即启动一级转录，而作为转录产物的正义RNA链被进一步翻译，用于生产介导病*基因组复制、二级转录、病*组装和出芽等病*等功能的后期蛋白。
病*蛋白开始合成后，N、P及L蛋白会逐渐积累并形成内含体。之后，病*RNA在内含体中进行复制。复制过程中，病*需要首先合成与负链基因组互补的(+)RNA分子，再以之为模板合成基因组RNA。（-）RNA有三重作用：其中部分作为模板合成新的(+)RNA，另部分作为模板再次进行转录(二次转录)，还有一部分则作为基因组包装到子代病*中。只有（-）RNA才能包装进入子代病*，因为（-）RNA5末端具有包装信号。
VSV的其他4种蛋白质的翻译过程都发生在细胞质游离的核糖体上，只有G蛋白例外，G蛋白在粗面内质网（ER）进行翻译，最后在高尔基体中修饰成熟。
M蛋白在病*装配过程中起着重要作用。一方面它能够将核衣壳压缩成紧实的螺旋结构，另一方面能够指导核衣结合到G蛋白大量表达的细胞质膜区域。随后，病*从这些质膜区域出芽，从而获得囊膜。M蛋白拥有一个晚期结构域(L)能够与出芽相关的宿主蛋白相结合。
M蛋白除了在病*装配过程中起关键作用，在抑制宿主基因表达过程也很重要。在感染早期，M蛋白大部分滞留在内吞体，还有小部分M蛋白释放到细胞质中并转运至细胞核，M蛋白能够抑制宿主的3种RNA聚合酶的转录，从而阻断宿舍细胞基因的表达。在动物细胞中，干扰素的合成收到抑制就是M蛋白这些功能综合作用的结果之一。
了解了VSV的感染复制过程，那么我们也可以像慢病*以及腺病*包装一样利用VSV包装成假病*颗粒，制备假型病*，研究病*进入细胞及传染机制。
VSV假病*包装原理
水疱性口炎病*（Vesicularstomatitisvirus，VSV）载体在研究病*颗粒入侵宿主细胞、辨认介导病*感染细胞的细胞表面受体、筛选病*抑制药物以及疫苗开发方面有着广泛的应用。VSV病*载体可以高效地利用异源病*的包膜蛋白进行假型化（Presudotypted），比如那些需要在高生物安全等级实验室操作的病*的包膜蛋白。
重组VSV是G糖蛋白基因缺失的，该缺失导致VSV自我复制缺陷的。G糖蛋白基因通常被替换为报告基因（如荧光蛋白基因、荧光素酶报告基因或分泌型碱性磷酸酶基因）用于病*的转导效果测定。
生产VSV假病*主要由三个步骤构成：1.使用质粒初步制备VSV；2.扩增G糖蛋白补全的VSV；3.使用异源病*的包膜蛋白组装VSV假病*。
进行重组VSV初步制备时，首先利用大肠杆菌构建一个可转录编码VSV基因组的负义RNA链的VSV-ΔG转移质粒，其转录产物作为RdRp合成病*RNA的RNA模板。该载体与四个辅助载体（分别表达VSVN、P、G和L蛋白）共转染至经牛痘病*接种的表达噬菌体T7RNA聚合酶的包装细胞。T7RNA聚合酶作用于转移质粒上的T7启动子，驱动VSV-ΔG基因组转录出负义RNA。重组VSV在包装细胞中组装并释放。收集细胞上清，用其再次感染表达有G糖蛋白的包装细胞，获得高产量的G糖蛋白补全的重组VSV。VSV假病*随后通过转导G糖蛋白补全的VSV至表达有异源病*包膜蛋白的包装细胞的方式制备。
VSV假病*应用举例
VSV转移质粒删除了VSV的G糖蛋白基因，因此可通过提供异源病*包膜糖蛋白的顺式元件来组装VSV假病*。
年12月FDA批准全球首个埃博拉疫苗-ErveboV就是基于此原理而研发而成，通过反向遗传操作，将EBOVGP蛋白替换VSV的G蛋白获得的重组VSV，改造之后的VSV疫苗既能让机体产生针对埃博拉病*的抗体，同时又没有致病性。
另外，我们还可以将VSV-G蛋白替换成SARS-CoV-2的S蛋白获得的重组VSV，S蛋白包被的假病*可以模拟冠状病*结合细胞表面受体进入细胞的过程。
冠状病*的刺突蛋白（S蛋白）在病*包膜外产生刺突形状并形成花冠一样的结构，冠状病*的名称由此而来。这些刺突首先帮助病*依附在宿主细胞表面，然后介导病*包膜与细胞膜的融合从而让病*颗粒进入细胞。
冠状病*包含大量的拥有不同宿主嗜性的病*类型。一种给定的冠状病*通常只能有效感染一种或几种宿主，这是由于一种给定病*类型的S蛋白只能特异地与它的宿主受体结合导致的。比如说，SARS-CoV和SARS-CoV-2，可分别引起SARS和COVID-19，它们的S蛋白通过与人类呼吸道、肺以及上皮细胞的表面ACE2受体结合感染人类。另一方面，MERS-CoV，引起了MERS，通过与人DDP4受体结合进入人体细胞。
对于理解冠状病*如何进入细胞，以及一种嗜性的冠状病*如何演化导致病*可以从一种宿主跨物种感染至另一种宿主的背后机制，研究不同冠状病*的S蛋白如何与它们的宿主受体结合是十分重要的。但是这样的研究通常难以实施，这是因为一些有活性的冠状病**株是危险的，比如说SARS-CoV-2这种病*只能在生物安全三级（BSL-3）的实验室进行操作。
作为使用活性冠状病*的替代方案，使用慢病*、VSV病*等工具病*进行人工重组获得的S蛋白假病*是一个更可行的方向。这些工具病*与冠状病*一样都是包膜病*，冠状病*的S蛋白可以同样被引入到工具病*的包膜结构上。以S蛋白包被的假病*可以模拟冠状病*结合细胞表面受体进入细胞的过程。用于制备假病*的工具病*本身是十分安全的，可以整合任何类型的冠状病*的野生型或者突变型的S蛋白。
使用ACE2过表达细胞株进行S蛋白假病*转导。同时引入EGFP或者荧光素酶，从而实现对病*进入宿主细胞的过程监测。
生产重组VSV有相当多的中间步骤，包括从质粒初步制备VSV、斑块纯化、生产G糖蛋白补全的VSV、使用异源病*的包膜蛋白组装VSV假病*等。这些步骤相对于传统的质粒转染要求运用到更复杂的技术。
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